Preguntas Frecuentes

La escala de síntesis se refiere a la cantidad de monómero unido al soporte que se utiliza para iniciar la síntesis de DNA, no a la cantidad de material final sintetizado. Cuando se especifica una escala de síntesis de 40 nmol, significa que se añaden al sintetizador de DNA aproximadamente 40 nmoles de la primera base. Para un promedio de 25-mer, al menos el 25 % de este material de partida dará lugar a secuencias fallidas, por lo que no es posible producir 40 nmoles de producto a una escala de 40 nmol. Las pérdidas de producto se producen durante la síntesis, el procesamiento postsintético, la transferencia de materiales y el control de calidad.

La eficiencia de acoplamiento es una forma de medir con qué eficacia une el equipo las nuevas bases a la cadena de DNA. Si todas las bases se unieran de forma 100 % eficiente, la eficiencia de acoplamiento sería del 100 %, pero pocas reacciones químicas lo son. Durante la síntesis de DNA, la máxima eficiencia de acoplamiento que se puede obtener es normalmente de alrededor del 99 %: en cada etapa de acoplamiento aproximadamente el 1 % de las bases disponibles no logra reaccionar.

La eficiencia de acoplamiento está influida de forma significativa por la calidad de la materia prima, por los equipos y por los protocolos de síntesis utilizados. El sistema de control de calidad de Metabion asegura que cada nuevo lote de productos químicos pasa controles estrictos y que los ciclos de síntesis están perfectamente ajustados al tipo de oligo.

Es importante porque los efectos son acumulativos durante la síntesis de DNA. La tabla muestra el efecto de una diferencia del 1 % en la eficiencia de acoplamiento y cómo influye en la cantidad de producto de longitud completa disponible tras la síntesis, según la longitud del oligo. Incluso con un oligo relativamente corto, de 20 bases, una diferencia del 1 % puede significar un 15 % más de producto de longitud completa.

La tabla también muestra que cuanto más largo es un oligo, menor es el rendimiento que se obtiene, debido a las limitaciones de la química. Aun con un 99 % de eficiencia de acoplamiento (en la práctica hay que asumir una eficiencia promedio del 98,5 %), el producto bruto de una síntesis de 95-mer consistiría en solo el 38,5 % de oligonucleótidos de longitud completa. La separación entre las secuencias de longitud completa y las fallidas se consigue por purificación por HPLC.

Depende de la complejidad de la molécula solicitada (longitud, composición de bases, modificaciones) y de la aplicación deseada. Las secuencias incorrectas pueden generarse tanto durante como después de la síntesis: por la propia naturaleza de la química de síntesis (eficiencia de acoplamiento < 100 %) y por los procedimientos de modificación postsintéticos, en el producto sin purificar quedan secuencias incorrectas (NX), modificadores libres y producto no marcado.

Recomendamos encarecidamente que todos los oligonucleótidos más largos de 80 nucleótidos y los modificados se sometan a purificación RP-HPLC, sin importar la aplicación.

Para aplicaciones críticas, como la síntesis de genes, la subclonación o la mutagénesis, se recomienda la purificación por HPLC para oligos de más de 45 nucleótidos.

Muchas de las amiditas modificadas son menos estables y no acoplan de forma tan eficiente como las bases no modificadas (aunque se usen procedimientos de acoplamiento más largos), por lo que las secuencias incorrectas son más abundantes que en una síntesis normal. En consecuencia, la mayoría de los oligos modificados deben purificarse por HPLC para eliminar esas secuencias, y el rendimiento se reduce como consecuencia de la purificación. El producto final, aunque con menor rendimiento, es mucho más puro y asegura que lo entregado está 100 % modificado.

Salvo que se solicite, los oligos se sintetizan sin ningún fosfato en 3' ni en 5'. Está disponible como una modificación adicional.

Los oligos estándar desalados no modificados (< 33 bases) pedidos antes de las 9 am se recibirán en Condalab al siguiente día hábil, siempre y cuando pasen el QC. Los oligos con purificación HPLC, más largos o con modificaciones necesitan, al menos, 2-4 días hábiles más para ser recibidos en nuestras instalaciones. Si un oligo no pasa el control de calidad, tiene que ser resintetizado y comenzar de nuevo.

Hay un grado normal de variación en la apariencia de los pellets secos de oligonucleótidos suministrados, y esa variación no indica por sí misma un defecto de calidad. En general, la apariencia puede ir de polvo a hialoidea. El color de los pellets de oligos no modificados puede variar de transparente a blanquecino y de amarillento a bronceado. Los pellets de oligonucleótidos marcados tienen el color del tinte que llevan.

Para obtener la máxima vida útil, las muestras deben almacenarse deshidratadas a ≤ –15 °C y en ausencia de luz. En estas condiciones, las muestras de DNA son estables durante al menos 24 meses. Para periodos de almacenamiento más prolongados, conviene comprobar la integridad molecular de los oligonucleótidos antes de usarlos en un experimento. Si se almacenan congelados a –20 °C o –70 °C, permanecerán estables durante varios meses. Debe evitarse la congelación y descongelación repetidas, ya que desnaturalizan el oligonucleótido. Además, la estabilidad en solución depende del pH: disolver oligonucleótidos en soluciones ácidas puede provocar su degradación, por lo que hay que evitar el agua destilada, cuyo pH puede llegar a ser de 4-5.

En los oligonucleótidos modificados, especialmente los marcados con fluorescencia, recomendamos además minimizar la exposición a la luz para evitar el blanqueo. Conviene almacenar los oligos marcados con colorante a concentraciones muy altas y no en diluciones de trabajo si no se van a usar en las 24 horas siguientes: cuanto mayor es el factor de dilución, más rápido desaparece la actividad fluorescente. Lo ideal es guardar alícuotas muy concentradas congeladas, descongelarlas una sola vez, diluirlas justo antes de usarlas y conservar las alícuotas a 4 °C y en oscuridad.

La etiqueta del tubo muestra la información básica: nombre del oligo, nombre de la persona que lo pidió, secuencia incluyendo modificaciones, oligo ID, cantidad de DNA (OD260), Tm y peso molecular.

Además se recibe una hoja de datos técnicos con información más detallada sobre las propiedades fisicoquímicas del oligo, como la composición de bases, el contenido en GC, la escala de síntesis, el grado de purificación, el control de calidad y el estado del envío.

Todos los oligos pasan un control de calidad por MALDI o ESI-ToF antes de enviarlos, pero la documentación solo se proporciona si se solicita al realizar el pedido y pueden aplicarse cargos adicionales. Estas son las opciones disponibles:

Mass Check

El control de calidad estándar que se hace a cada oligo. Es gratuito y no incluye documentación impresa ni en PDF.

MALDI-ToF

Solo bajo pedido, con cargos adicionales. Se envía el producto con el espectro MALDI-ToF.

ESI-ToF

Solo bajo pedido, con cargos adicionales. Se envía el producto con el espectro ESI-ToF.

Mass Check + HPLC analítica

Solo bajo pedido, con cargos adicionales. Se envía el producto con el espectro de la HPLC analítica y el de masas.